Jeruk purut (Citrus hystrix) merupakan tanaman dari suku Rutaceae yang telah lama dikenal masyarakat sebagai bahan cita rasa. Hasil penelitian sebelumnya melaporkan bahwa minyak atsiri jeruk nipis (Citrus aurantifolia) memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Penelitian ini bertujuan untuk mengukur aktivitas antibakteri minyak atsiri daun jeruk purut terhadap  Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dan mendeteksi kandungan minyak atsiri yang mempunyai aktivitas antibakteri. Minyak atsiri daun jeruk purut yang diperoleh dengan cara destilasi uap dan air diuji aktivitas antibakterinya menggunakan metode dilusi cair. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan menggunakan silika gel GF₂₅₄ dan heksan-etil asetat (9:1). Bercak hasil KLT dideteksi dengan UV₂₅₄nm, UV₃₆₆nm, anisaldehid-asam sulfat, dan vanilin-asam sulfat. Bioautografi dilakukan dengan metode kontak. Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa minyak atsiri daun jeruk purut mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dengan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) berturut-turut sebesar 1  dan 2%. Minyak atsiri juga mampu menghambat dan membunuh Escherichia coli dengan nilai KHM dan KBM £ 0,0625%. Hasil KLT menunjukkan bahwa minyak atsiri daun jeruk purut mengandung beberapa senyawa golongan terpen dengan Rf yang berbeda. Berdasarkan hasil bioautografi, salah satu senyawa golongan terpen tersebut mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.